Skaitmeninė PGR
Skaitmeninė polimerazės grandininė reakcija (skaitmeninė PGR) - tai pažangi molekulinės diagnostikos technologija, leidžianti itin tiksliai nustatyti ir kiekybiškai įvertinti DNR ar RNR fragmentus tiriamajame mėginyje. Šis metodas pasižymi ypač dideliu jautrumu, todėl puikiai tinka retų mutacijų, mažos koncentracijos patogenų ar subtilių genetinių pakitimų aptikimui.
Veikimo principas
- Skirtingai nuo tradicinės PGR, skaitmeninė PGR suskaido mėginį į tūkstančius (ar net milijonus) atskirų mikroreakcijų - kiekvienoje iš jų vyksta atskira amplifikacijos reakcija.
- Po amplifikacijos kiekviena mikroreakcija įvertinama kaip teigiama (joje buvo norimas fragmentas) arba neigiama. Remiantis šiuo „taip/ne“ principu, absoliutus tikslinės sekos kiekis apskaičiuojamas pagal Poasono statistiką.
Kodėl skaitmeninė?
- Šis metodas nereikalauja etaloninės kreivės - kiekis nustatomas tiesiogiai, todėl jis yra tikslesnis ir mažiau priklausomas nuo techninių variacijų.
- Skaitmeninė PGR yra itin jautri ir gali aptikti net pavienius molekulinius pokyčius didelės koncentracijos foniniame triukšme. Tai ypač vertinga onkologijoje (likutinės ligos nustatymui) ir retų virusinių apkrovų matavimui.
Procedūra
- Iš paciento paimamas biologinis mėginys (kraujas, audinys, skrepliai ar kt.).
- Laboratorijoje iš mėginio išskiriama DNR arba RNR.
- Paruošiamas reakcijos mišinys su specifiniais pradmenimis ir zondais.
- Mišinys padalinamas į šimtus tūkstančių atskirų lašelių arba specialių mikrošulinių (priklausomai nuo platformos).
- Kiekviename lašelyje vykdoma amplifikacija termocikliu.
- Galiausiai kiekvienas lašelis analizuojamas, suskaičiuojama teigiamų ir neigiamų reakcijų dalis ir pagal ją nustatomas absoliutus tikslinės sekos kiekis.
Teigiamas radinys
- Teigiamas rezultatas rodo, kad mėginyje yra ieškomas genetinis fragmentas - pavyzdžiui, konkreti mutacija, viruso DNR ar bakterijos genas.
- Kiekybinė išraiška (pvz., kopijų skaičius viename mililitre) leidžia įvertinti patogeno kiekį ar genetinės anomalijos paplitimą. Tai padeda stebėti ligos progresiją, gydymo efektyvumą ar likutinės ligos apimtį.
Neigiamas radinys
- Neigiamas rezultatas reiškia, kad iš duoto mėginio norimo fragmento neaptikta. Tai gali reikšti, kad tiriamoji seka organizme nėra, arba jos kiekis yra mažesnis už metodo aptikimo ribą.
- Dėl itin didelio jautrumo, neigiamas skaitmeninės PGR rezultatas suteikia didelį pasitikėjimą, kad patogeno ar mutacijos nėra. Vis dėlto, sprendimą visada reikia vertinti klinikiniame kontekste.
Dažniausios situacijos
- Onkologijoje: likutinės ligos stebėjimui po gydymo, ankstyvam recidyvo nustatymui arba mutacijų profiliui tirti.
- Infekcinėse ligose: mažos koncentracijos virusų (pvz., ŽIV, hepatito B/C, citomegaloviruso) ar bakterijų (pvz., tuberkuliozės) kiekybiniam nustatymui.
- Prenatalinėje diagnostikoje: negimdinės DNR fragmentų analizei iš motinos kraujo.
- Genetikoje: retų alelių ar mozaicizmo nustatymui.
