Reversinės transkripcijos PGR
Reversinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (RT-PGR) - tai jautrus molekulinės diagnostikos metodas, naudojamas RNR aptikti ir kiekybiškai įvertinti. Šis tyrimas ypač svarbus virusinėms infekcijoms (pvz., SARS-CoV-2, gripui, ŽIV) nustatyti, taip pat onkologijoje navikinių ląstelių genų ekspresijai tirti. RT-PGR sujungia atvirkštinę transkripciją (RNR pavertimą DNR) ir klasikinę PGR, leidžiančią amplifikuoti tikslinę nukleorūgštį.
Funkcija
- Aptinka ir kiekybiškai nustato RNR sekas mėginyje
- Leidžia diagnozuoti aktyvias virusines infekcijas (nes virusai dažnai turi RNR genomą)
- Naudojamas genų ekspresijos tyrimuose - nustato, kokie genai aktyvūs ląstelėse
Kilmė ir principas
- Metodas sukurtas 8-ajame dešimtmetyje, patobulinus klasikinę PGR
- Pirmiausia atliekama atvirkštinė transkripcija: fermentas reversinė transkriptazė paverčia RNR į komplementarią DNR (cDNR)
- Vėliau cDNR amplifikuojama standartine PGR, naudojant specifinius pradmenis ir DNR polimerazę
Procedūra
- Dažniausiai tyrimui imamas tepinėlis iš nosiaryklės, kraujo mėginys arba biopsinė medžiaga
- Mėginys apdorojamas tirpalu, išskiriant RNR
- Pridedami specifiniai pradmenys, nukleotidai, reversinė transkriptazė ir DNR polimerazė
- Atliekamas ciklinis temperatūros keitimas: denatūracija (DNR išsiskiria), hibridizacija (pradmenys prisijungia) ir elongacija (naujos grandinės sintezė)
- Rezultatas stebimas realiuoju laiku (naudojant fluorescencinius žymenis) arba po PGR elektroforezės būdu
Ką reiškia teigiamas rezultatas?
- Rasta konkreti RNR seka - tai patvirtina aktyvią infekciją (pvz., SARS-CoV-2, gripą, ŽIV, hepatitą C) arba specifinio geno ekspresiją navikinėse ląstelėse
- Rezultatas gali būti pateikiamas kaip aptikta/neaptikta arba kiekybiškai (CT vertė - kuo mažesnė, tuo daugiau RNR mėginyje)
- Teigiamas rezultatas neatsako, ar liga jau praėjusi - gali išlikti RNR fragmentai net ir po simptomų išnykimo
Interpretacijos niuansai
- Klaidingai teigiamas rezultatas gali atsirasti dėl mėginio užteršimo arba kryžminės reakcijos su panašiomis RNR sekomis
- Kiekybinė RT-PGR (qRT-PCR) leidžia stebėti viruso kiekio pokyčius gydymo metu
Infekcinės ligos
- Įtariant ūmią virusinę infekciją (COVID-19, gripą, kito tipo koronavirusus)
- Lėtinėms virusinėms infekcijoms (ŽIV, hepatitas B, C, citomegalovirusas) diagnozuoti ir stebėti
Onkologija ir genetika
- Tiriant vėžio ląstelių genų ekspresijos profilius (pvz., krūties vėžio receptorių tyrimai)
- Nustatant minimalią liekamąją ligą (MRD) po gydymo
Gydytojų specialybės
- Infekcinių ligų gydytojas - užsako tyrimą įtarus virusinę infekciją
- Onkologas - naudoja RT-PGR navikinių mutacijų ir ekspresijos nustatymui
- Genetikas - vertina genų ekspresijos pokyčius ir nustato paveldimas ligas
